蛋白質組學在中藥現代化研究中的應用

發布時間：2005-08-11

隨著人類社會回歸自然的呼聲越來越高，世界上更多的人們把關注的焦點放在了天然產物的研究上。受此熱潮影響，中藥現代化的研究正以突飛猛進的速度，借助現代科學技術手段向我們走來。1994年澳大利亞的Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出了蛋白質組（proteome）。蛋白質組學（proteomics）是指通過生化方法對蛋白質進行大規模研究的科學。蛋白質組學的研究領域包括以下3個方面：①蛋白質大規模鑒定和轉錄后修飾的微特征研究；②差異顯示蛋白質組學，即對腫瘤等疾病有廣泛應用前景的蛋白質表達水平的比較；③應用質譜技術和酵母雙雜交體系對蛋白質間相互作用的研究。如果說基因組學（genomics）是一種對細胞的靜態描述，主要指其結構和功能；而蛋白質組學才是真正的對基因的功能（或稱結果）進行研究的一門科學，是專門研究細胞內全部蛋白的動態表達，其不但包括功能基因組學中所指的全部蛋白，而且還包含一部分非基因組編碼的蛋白，如病毒中的蛋白（其不是由基因組編碼），故通常亦稱之為功能基因組學（functional genomics）?；诖?，蛋白質組學能較實際地反映機體生物代謝的一些基本問題，深化生命科學認識。這將極大推進生物技術（基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程、發酵工程等）向更精確、更高效，具有更高的可利用性和開發性的方向發展，并將涉及涵蓋到醫學、藥學、農業等相關領域，使其內在的常規格局發生變革。

1、蛋白質組學的內容、技術手段及意義

1.1  蛋白質組學的內容：與基因組的均一性相比，蛋白質組則具有多樣性。即在同一生物個體的所有體細胞中基因是一樣的，但在生命發育不同階段的細胞中蛋白質種類及數量卻是大相徑庭，不同組織中細胞表達的蛋白質也有很大差異；其次，基因組非常穩定，而蛋白質組則是動態變化的。即同一細胞在不同時期、不同條件下，其蛋白質組也是在不斷地改變之中。利用這一特點，可以多點切入蛋白質組的研究。功能蛋白質組學（functional proteomics）的研究即注重從局部入手，主要研究細胞內的蛋白質群體，群體范圍可大可小，重點放在那些可能涉及到特定功能機制的蛋白質群體上。不斷地把許許多多不同的蛋白質群體統計組合，從而描繪出接近于生命細胞的“全部蛋白質”的蛋白質組圖譜。

蛋白質組學的內容主要有“蛋白質組技術體系”和“蛋白質組信息學”兩方面的研究。蛋白質組技術體系包括：蛋白質組的樣品制備和鑒定、蛋白質相互作用網絡的研究技術等；蛋白質組信息學則涉及蛋白質組數據庫的建立，相關軟件的應用與開發和生物信息學。即在研究體系建立與不斷完善的同時，針對一些重要的生物學問題進行功能蛋白質組研究。首先，要選擇有很好研究積累的細胞與生物大分子（蛋白質/基因）的較完整研究系統，利用所建立的相應蛋白質組圖譜方法，獲取各種重要條件作用前后的同類蛋白質組圖譜，并利用計算機圖像技術系統分析比較，確定在數量及形式、修飾度或定位等發生變化的蛋白質群體。然后，對重要內外環境因素、基因突變等條件直接作用相關的蛋白質群體進行時相、初級和次級等變化的詳細研究分析，從中發現重要的蛋白質群體及其活動規律和關鍵蛋白質，再深入進行它的組分及其性質的鑒定。由此創建各種細胞的蛋白質組數據庫，并進而開展重要的蛋白質結構預測、三維結構和動態結構研究，在分子水平上深入探索其作用模式、功能機制、調節控制及其在蛋白質群體內或與相關生物大分子間的相互作用。

1.2  蛋白質組學的主要技術：蛋白質組學研究對象主要是細胞或有機體中所有的蛋白質。研究其結構與功能，對其進行定性、定量和作用展示的研究。首先對生物學體系中的復雜蛋白質混合物進行分離與鑒定。由于生物體系中各種不同種類的蛋白質含量差別較大，而且隨體系所處的環境呈現動態變化，溶解性、酸堿性、相對分子質量等差異較大，因此需要采取相應的分離純化方法和技術手段進行研究。蛋白質組學研究中常常涉及的相關技術包括樣品的處理技術、雙向電泳分離技術、蛋白質分析技術如相對分子質量的測定、序列的測定、N-末端、C-末端的測定、膠團以及相關的結構與功能研究、數據庫檢索分析等信息學技術。

1.3  研究蛋白質組學的意義：通常認為，蛋白質的表達可以通過基因產物——mRNA水平反映出來，然而最新研究表明，基因的表達水平與細胞中相應蛋白質的含量并沒有嚴格的一致性，所以對于基因組的研究并不能取代蛋白質組的研究。造成這一現象的主要原因有：（1）基因表達與相應的蛋白質表達存在時間上的差異；（2）基因表達的部位與相應蛋白質執行功能的部位有所不同；（3）mRNA及蛋白質的穩定性有所不同；（4）mRNA在轉錄后可生成不同的蛋白質；（5）蛋白質的修飾如磷酸化和糖基化對于蛋白質的活化及執行功能具有非常重要的影響。這一發現使得研究細胞中蛋白質的表達豐度對于研究疾病的分子機制及新藥開發具有非常重要的意義。研究表明，只有約2%的疾病與基因序列有關，98%的疾病與蛋白質的表達有關，僅依靠基因水平的分析有時并不足以了解疾病發生的機制。蛋白質組學可以直接在分子水平闡述蛋白質修飾、蛋白質之間相互作用及蛋白質的作用機制等問題，這樣有利于弄清疾病發生、發展以及藥物治療的分子機制，也便于開發更有效的中藥制劑。所以，特定細胞的蛋白質組資料與基因組資料的相互補充和完善，也有助于疾病機制的研究及中藥現代化的系統開發。

2、蛋白質組學在中藥現代化中的應用

面臨這樣一個分子生物學快速發展的新時代，中藥現代化研究應該借鑒其新觀念和新技術，來發展和完善自身理論體系，加速中藥現代化進程。

2.1  中藥材或制劑有效部位或有效成分作用靶點的識別：中藥進入體內發揮作用的基本環節是藥物分子與細胞之間的直接或間接的相互作用。中藥材中所含化學成分非常復雜，基于以往的分析技術，進行多組分同時分離篩選存在很多困難，采用有效部位加以描述，難以準確確定其中的有效成分。而中藥復方的化學研究由于其復雜性和整體性，更加難以確定其中的有效成分。況且由于單味藥材的化學研究尚未解決，多味藥相互作用過程的化學成分研究更是有待進一步深入。這是從傳統化學成分研究角度研究中藥所遇到的難題。

中藥制劑有效部位或有效成分進入人體，發揮作用，必然會引起從遺傳信息到整體功能實現中的分子、細胞、器官、整體多個層面的結構與功能狀態的改變，調節這些層面的結構與功能的本質是基因，而直接的作用者主要是蛋白質。因此，以蛋白質表達為指標，以蛋白質調控改變和功能修飾為研究方向，進行中藥復方有效部位或有效成分多組分、多環節、多靶點治療調整作用的研究。具體來說，以蛋白質組學理論為指導，對中藥制劑有效部位或有效成分作用靶點識別的大量結果，進行系統化分析和整理，從而建立系統化的生命模式背景，以及中藥制劑有效部位或有效成分作用靶點的識別體系，進而可以指導和預見中藥材或制劑中化學成分的發現和分離。與疾病相關的靶基因作為中藥作用的最本質的治療指標，可望對中藥制劑有效部位或有效成分的識別研究取得突破性進展。

2.2  中藥材或制劑的藥理作用研究：中藥藥理學研究的主要任務是揭示中藥治療的作用機制和機體對藥物處理過程的研究。該過程是一個涉及多成分、多靶點、多途徑的作用過程。從中藥角度看，由于成分復雜，單味藥材就是一個化學分子庫，復方是單味藥材按照特定組織原則組織起來的多個化學分子庫的組合。雖然不是所有化學成分都是有效成分，但在發揮作用過程中，各成分之間存在相互協同或抑制作用；另外，從機體角度看，機體本身是一個極其復雜的巨系統，每個系統中都包含著多因素的問題。疾病的發生大多也是多種病因通過多種途徑導致整體功能紊亂的過程。研究這樣兩個多因素系統的相互作用，其復雜程度可想而知。從機體而言，機體生命活動規律的認識是研究深入的關鍵。

在蛋白質組時代可從分子水平揭示中藥復方作用機制。中藥治療疾病不是單純強調以藥物去直接對抗致病因子，重點在于調整機體功能狀態，發揮機體抗病能力。中藥復方在對機體功能狀態調節過程中，涉及到細胞、器官、整體多個層面，對多層面的系統關聯性研究正是蛋白質組時代的主要任務。同時，依據多基因致病的關聯特性，通過蛋白質表達譜和表達產物的差比性分析，可以揭示證候發生和發展的分子水平調控規律，進而可能揭示中藥復方的作用靶點、作用環節和作用過程。也就能發現復方中的有效成分及各成分間的協同關系，進一步實現復方的優化組合，實現由天然藥物組方向化學成分組方的轉化，從而可能會更清晰的闡述中藥復方在分子水平的作用機制。

2.3  瀕危中藥材的細胞培養工程：運用生物技術來生產中藥有效成分，即瀕危藥用中藥材的大規模細胞培養工程，成為一種必然趨勢。在后基因組時代，通過功能基因組和蛋白質組的研究，在了解遺傳信息表達和調控規律基礎上，用控制遺傳信息的方式來促進中藥材有效成分的細胞培養合成。如從黃連細胞培養物中生產黃連堿，人參根細胞中生產人參皂苷，長春花中生產吲哚堿，丹參中生產丹參酮，青蒿中生產青蒿素等。在20世紀80年代后期，藥用植物有效成分基因調控方面的研究就已經開始，紅豆杉等藥材進行過這方面的研究。20世紀90年代以后，一些結構復雜的藥用植物有效成分生物合成途徑及其基因調控規律已逐漸被揭示出來，而且有些有效成分生物合成的人工調控已獲得了初步成功，元英進教授領導的課題組長期研究各種誘導子對紅豆杉細胞體系誘發凋亡，考察凋亡過程中蛋白質的豐度及差異蛋白的顯示，考察紫杉醇產量，使結果向提高紫杉醇產量的方向發展。隨著功能基因組和蛋白質組的研究，遺傳信息的表達調控規律和所表達蛋白質的生物功能將得到更多地闡明，生命科學認識將逐步深入，從而推動中藥有效成分系統分析和利用生物技術合成的發展，這一領域展示出十分誘人的前景。
2.4  瀕危中藥材相關替代及道地藥材功能基因組研究：在后基因組時代，通過蛋白質組的研究，在越來越多了解有效成分作用靶點、調控規律的基礎上，可以用監控細胞蛋白表達差異或體內代謝方向的方式研究瀕危中藥材的相關替代，促進中藥材的充分合理利用。

對于中醫藥理論認為具有很好臨床療效和突出治療作用的中藥材如紅豆杉（突出的抗癌作用）、虎骨（突出的祛風濕、定痛療效）、麝香（突出的開竅、通絡作用）等，而又屬于瀕危稀有動植物保護資源的，可以考慮采用相近種屬替代，或者改變用藥部位的方式，達到既保護資源，又能夠充分利用的目的。傳統的替代藥材研究中，由于研究主體所含化學成分非常復雜，不僅所含化學成分種類不盡相同，即使化學成分類別相同，但所含各主成分之間的比例、微量元素含量及比例、主成分化合物存在方式的不同，其發揮治療作用的效果就會大不相同。分析檢測多組分的分離篩選有效成分存在很多困難，采用有效部位或指標性成分加以描述，難以確定其中的有效成分。多味藥的復方相互作用過程的化學研究更是無法進一步深入明確其成分及機制，所以，難以篩選出合理的相關替代品。蛋白質組學的研究方向則認為有效部位或有效成分進入細胞或人體，發揮作用必然會引起整體功能的分子、細胞、器官、整體多個層面的結構與功能狀態的改變，毫無疑問，直接的改變主要是蛋白質，蛋白質的調控發生了改變或功能發生了修飾。因此，以蛋白質的豐度或表達為指標，對作用靶點識別，建立作用靶點的識別體系并進行系統化分析歸納，找出相似作用方式的相關成分，對比考察替代品與傳統上應用的瀕危中藥材的各蛋白質表達豐度、表達種類相似與否，即可篩選出最佳替代。因此，利用蛋白質組學的技術手段進行瀕危藥用中藥材或不同藥用部位的相關替代研究是可行的。

另外，因為綠色開花植物的基因組之間具有相似性，利用植物研究中的基因組技術，從眾多臨床中常用的中藥材，選取一些具有代表性藥材特征的范例，作為研究某一應用領域的模式植物，進行植物功能基因組研究，也可以為深入有關中藥材的道地藥材，科學種植等相關研究提供有力的科學依據。

2.5  有利于中藥指紋圖譜的更加合理化：中藥指紋圖譜現已成為研究中藥制劑乃至世界各國植物藥制劑的物質基礎和作用機制的一種新模式和研究體系。指紋圖譜除了包括通常所說的和化學成分相關的色譜、光譜指紋圖譜外，還包括其他類多維多息中藥生物指紋圖譜，如基因組學指紋圖譜和蛋白質組學指紋圖譜等。中藥指紋圖譜能較完整地表征中藥制劑復雜的物質基礎（化學成分群）的大量信息，同時，也能夠表征各種藥理活性和藥效作用（包括臨床療效）；反過來，比較不同蛋白質組指紋圖譜體現的不同藥效結果，就可確定何種物質基礎（化學成分群）是該中藥制劑的最佳方式，此時這張指紋圖譜不但包含了化學信息，也體現了和此相關的藥效、臨床療效等生物醫藥信息，這就是多維多息指紋圖譜的含義。

中藥生物指紋圖譜包括：中藥基因組學指紋圖譜、中藥蛋白組學指紋圖譜和中藥材DNA指紋圖譜。其中中藥基因組學圖譜和蛋白質組學指紋圖譜系指用中藥制劑作用于某特定細胞或動物后，引起的基因或蛋白的特定構象。復雜的變化情況，這兩種指紋圖譜似可稱為生物活性指紋圖譜。目前，中藥基因組學和蛋白質組學有關指紋圖譜的研究工作正在開展。由于宏觀上中藥作用靶點和作用機制的多樣性及對基因作用的多樣性，中藥蛋白質組學指紋圖譜，可在分子水平上豐富整個中藥指紋圖譜研究體系。無論是中成藥二次開發，還是中藥新藥研究，一個關鍵問題需要解決，即逐步在分子水平上研究解決化學成分（物質基礎）和藥理作用、藥效活性的相關性，而其中，通過蛋白質組學的研究得到的蛋白質組學指紋圖譜又具有很高的說服力。從中藥新藥研究出發，可在開始研究階段，即同時進行化學成分指紋圖譜和蛋白質組指紋圖譜的研究，一舉達到建立同時體現化學和分子生物藥效信息的蛋白質指紋圖譜。這樣，中藥新藥開發研究乃至整個中醫藥理論將會增添更多的方法和內容，實現中醫藥理論質的飛躍。

3、未來蛋白質組學的發展方向

目前的蛋白質組學尚存在其明顯的不足，具體表現在對整體蛋白質的辨別能力及鑒定能力有待進一步提高，對疏水性強、相對分子質量較小和較大、酸堿性較強的蛋白質，以及分離后膠上蛋白質的回收等均需有較大的改進與提高，簡化操作，開發價廉易使用的儀器設備，采用自動化快速分析等手段仍是蛋白質組學未來研究的方向。但隨著蛋白質雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術的發展，各種質譜技術的完善及新型儀器的應用，以及網絡化、系統化生物信息學的迅速普及與應用，蛋白質組學在自身相關技術如樣品制備、靈敏度、準確度、重復性及高通量、自動化方面取得了豐富的經驗和較大的進展，新技術、新方法、新的儀器設備應用于蛋白質組學研究，都將使蛋白質組學與中藥現代化的聯系更加緊密。同時應該集中蛋白質及細胞、基因等方面的優勢研究力量，充分利用各種已有的研究基礎與積累，開展蛋白質組學與中藥現代化的研究，試著建立蛋白質組學與中醫藥相關聯的轉換模式概念，為揭示諸如疾病狀態下的代謝調控等生命活動的規律上取得突破，為探討中藥治療重大疾病的機制、診斷和防治以及新型中藥制劑開發提供理論基礎。

( 中國醫藥數字圖書館 )

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