總膽堿的測定方法

發布時間：2005-09-06

比色法
1.原理
食物中的膽堿經過堿處理提取后，通過Florisil柱色譜純化，然后用雷納克鹽（reineckate）與膽堿反應形成粉紅色的膽堿-雷納克鹽復合物，這種復合物被丙酮洗脫后，在526nm有最大吸收，其吸收值與膽堿濃度成正比。
2.適用范圍
參照《Methods of Vitamin Assay》。使用于各類食物中膽堿的測定。最小檢出限為0.15mg。
3. 儀器與設備
（1）實驗室常用設備。
（2）回流提取裝置。
（3）色譜柱：為0.8cm（內徑）×30cm的玻璃柱，柱上端為容積30～50ml的儲液池，底端收縮變細，并裝有活塞?；钊霞s1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm。
（4）分光光度計。
4. 試劑
除特殊說明外，所有試劑均為分析級，實驗用水為蒸餾水。
（1）甲醇。
（2）氯仿。
（3）乙酸甲酯。
（4）丙酮：用前重蒸餾。
（5） 10% 丙酮：取50ml丙酮溶解于450ml水中。
（6）冰乙酸。
（7）冰乙酸-甲醇溶液：取50ml冰乙酸和400ml甲醇混合。
（8）飽和氫氧化鋇提取液：于1000ml甲醇中加入40g無水Ba(OH)2，攪拌10min,再加入100ml氯仿，混合，使Ba(OH)2飽和，過濾去除多余的Ba(OH)2。
（9）硅鎂吸附劑（Florisil）：Sigma 公司，60～100目。
（10）雷納克銨（Ammonium Reineckate）飽和溶液：稱取2～3g雷納克銨，加入100ml水中，攪拌10min ,過濾去除多余的雷納克銨。實驗當日配制。
（11）膽堿標準貯備液（5g/L）：準確稱取無水氯化膽堿0.57613g，溶解于水中，并定容至100mL。冰箱保存。
（12）膽堿標準工作液（1g/L）：準確吸取2.0ml標準貯備液，用水稀釋定容至100ml。
5.測定步驟
所有操作均需避光進行
5.1 提?。悍Q取適量樣品（約含5～50mg膽堿），置于100ml具塞錐型瓶中，加入30ml提取液，邊加邊搖，避免結塊。然后放置于76℃～80℃恒溫水浴回流2～4h，回流速度為1～2滴/秒。（注：加熱回流的溫度應嚴格控制在80℃左右，否則樣品易撲濺，造成損失。樣品提取率與回流時間有關，回流2小時，提取率達到最高值，回流3～4小時，可以保證樣品提取較完全。）冷卻，樣品過濾至100ml容量瓶中，反復用5～10ml冰乙酸-甲醇溶液洗滌錐形瓶和濾渣，濾液并入容量瓶中。用pH試紙測定提取液pH在2～6范圍之內（必要的話可加入冰乙酸調節pH），然后用甲醇定容至刻度。
5.2 純化
（1）填裝色譜柱：將硅鎂吸附劑浸入甲醇中，濕法將硅鎂吸附劑填充入色譜柱中（注：色譜柱最好經過干燥處理，否則影響洗脫液流速），至硅鎂吸附劑的高度達10cm（約4g）。用甲醇沖洗色譜柱，并保持甲醇高于硅鎂吸附劑頂端0.5～1cm。
（2）柱色譜純化：吸取一定量的提取液加到色譜柱中，打開底端活塞，使提取液靠重力作用通過色譜柱。先后用5ml，10ml甲醇洗滌色譜柱。待甲醇通過色譜柱后，依次用2份10ml乙酸甲酯，10ml冷的10%丙酮洗滌色譜柱。接著加入5ml雷納克銨飽和溶液（雷納克銨與吸附于色譜柱上的膽堿結合），待雷納克銨飽和溶液完全通過色譜柱后，用2份10ml冰乙酸洗滌直至流出液清亮為止（冰乙酸的作用是洗脫未與膽堿結合的過量的雷納克銨，應注意洗脫完全）。用15ml丙酮洗脫色譜柱上膽堿-雷納克鹽復合物的粉紅色色譜帶，收集洗脫液，并用丙酮定容至15ml。
5.3 比色測定：用1cm比色杯，以丙酮調節零點，于526cm波長下，測定樣品吸光度，其值在標準工作曲線上查出，或通過回歸方程計算出對應的膽堿含量，供計算使用。
5.4標準工作曲線：分別吸取0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml標準工作液（3.13），加至色譜柱上，按照上述樣品測定步驟操作。以膽堿含量做橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。
6.計算
C ×V1×100
X= -------- ×100
V2 × m
式中：
X--樣品中膽堿的含量，（mg/100g）；
C--從標準工作曲線或回歸方程中查到的膽堿含量，mg；
V1--樣品提取液的總體積，ml
V2--純化用提取液的體積，ml；
m--樣品質量，g
7.注意事項
（1）同一實驗室平行測定或重復測定結果的相對偏差絕對值＜10%。
（2）硅酶吸附劑填充的高度關系到洗脫液的用量，如果填充過高，則應加大洗脫液用量，以保證膽堿的純化和完全洗脫。
（3）純化過程中冰乙酸的作用是將不能與膽堿形成復合物的多余雷納克銨鹽洗脫，丙酮則是洗脫膽堿-雷納克銨復合物，如果這兩步洗脫不完全，均影響膽堿的測定，所以必要時應增加冰乙酸和丙酮的用量以保證測定結果。

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