膳食纖維的測定方法

發布時間：2005-09-13

酶-重量法
1.原理：
樣品分別用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶進行酶解消化以去除蛋白質和可消化的淀粉?？偵攀忱w維（TDF）是先酶解，然后用乙醇沉淀，再將沉淀物過濾，將TDF殘渣用乙醇和丙酮沖洗，干燥稱重。不溶性和可溶性膳食纖維（IDF和SDF）是酶解后將IDF過濾，過濾后的殘渣用熱水沖洗，經干燥后稱重。SDF是將上述濾出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再過濾，干燥，稱重。 TDF、IDF和SDF量通過蛋白質、灰分含量進行校正。
2.適用范圍
AOAC991.43 本方法適用于各類植物性食物和保健食品。
3.儀器
3.1燒杯：400或600ml高腳型。
3.2 過濾用坩堝：玻料濾板，美國試驗和材料學會（ASTM）40-60μm，Pyrex 60ml（Corning No.36060 buchner，或同等的）。如下處理：
（1）在灰化爐525℃灰化過夜。爐溫降至130℃以下取出坩堝。
（2）用真空裝置移出硅藻土和灰質。
（3）室溫下用2%清洗溶液浸泡1小時。
（4）用水和去離子水沖洗坩堝；然后用15ml丙酮沖洗然后風干。
（5）在干燥的坩堝中加0.5g硅藻土，在130℃烘干恒重。
（6）在干燥器中冷卻1小時，記錄坩堝加硅藻土重量，精確至0.1mg。
3.3 真空裝置：
（1）真空泵或抽氣機作為控制裝置。
（2） 1L的厚壁抽濾瓶。
（3）與抽濾瓶相配套的橡皮圈。
3.4振蕩水浴箱：
（1）自動控溫使溫度能保持在98±2℃。
（2）恒溫控制在60℃。
3.5 天平：分析級，精確至±0.1mg。
3.6馬福爐：溫度控制在525±5℃。
3.7干燥箱：溫度控制在105和130±3℃。
3.8干燥器：用二氧化硅或同等的干燥劑。干燥劑兩周一次在130℃烘干過夜。
3.9 PH計：注意溫控，用pH4.0、7.0和10.0緩沖液標化。
3.10 移液管及套頭：容量100μl和5ml。
3.11 分配器或量筒：
（1） 15±0.5ml，供分配78%的乙醇，95%的乙醇以及丙酮。
（2） 40±0.5ml，供分配緩沖液。
3.12. 磁力攪拌器和攪拌棒。
4. 試劑
全過程使用去離子水，試劑不加說明均為分析純試劑
4.1 乙醇溶液：
（1） 85%：加895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀釋至刻度。
（2） 78%：加821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀釋至刻度。
4.2 丙酮：
4.3 供分析用酶：在0-5℃下儲存。
（1）熱穩定α-淀粉酶溶液：Cat. No. A3306，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO63178，或 Termamyl 300L，Cat. No. 361-6282，Novo-Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。
（2）蛋白酶：Cat. No. P3910，Sigma Chemical Co.，或等效的。當天用MES/TRIS緩沖液中現配50mg/ml酶溶液。
（3）淀粉葡糖苷酶溶液：Cat. No. AMG A9913，Sigma Chemical Co.，或等效的。
4.4 硅藻土：酸洗（Celite 545 AW，No.C8656，Sigma Chemical Co.，或等效的）。
4.5 洗滌液：兩者挑一。
（1）鉻酸：120g重鉻酸鈉Na2Cr2O7·2H2O，1000ml蒸餾水和1600ml濃硫酸。
（2）實驗室用液體清潔劑，預備急需清洗的（Micro，International Products Corp.，Trenton，NJ08016，或等效的）。用水配制2%溶液。
4.6 MES-TRIS緩沖液：0.05mol/L，溫度在24℃時pH值為8.2。
（1） MES：2-（N-嗎啉代）磺酸基乙烷（No.M-8250，Sigma Chemical Co.或等效的）。
（2） TRIS：三羥（羥甲基）氨基甲烷（No.T-1503，Sigma Chemical Co.或等效的）。
在1.7L的蒸餾水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS，用6mol/L NaOH調pH到8.2，用水定容至2L。（注意：24℃時的pH為8.2，但是，如果緩沖液溫度在20℃，pH就為8.3，如果溫度在28℃，pH為8.1。為了使溫度在20-28℃之間，需根據溫度調整pH值。）
4.7 鹽酸溶液：0.561mol//L，加93.5ml6mol/L鹽酸到700ml水中，用水定容至1L。
5. 操作方法
5.1. 樣品制備：
（1）固體樣品：如果樣品粒度＞0.5mm，研磨后過0.3-0.5mm（40-60目）篩。
（2）高脂肪樣品：如果脂肪含量＞10%，用石油醚去脂。每克樣品用25ml，每次提取完靜置一會兒再小心將燒杯傾斜，慢慢將石油醚倒出，共洗三次。
（3）高碳水化合物樣品：如果樣品干重含糖＞50%，用85%乙醇去除糖份，每克樣品每次10ml，共洗三次輕輕倒出，然后在40℃烘箱中不時翻攪干燥過夜，并研磨過0.5mm篩。
5.2. 樣品消化
（1）準確稱取雙份1.000±0.005g樣品（M1和M2），置于高腳燒杯中。
（2）在每個燒杯中加入40ml MES-TRIS緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌直到樣品完全分散。（防止團塊形成，使受試物與酶能充分接觸）。
（3）用熱穩定的淀粉酶進行酶解處理：加100μl熱穩定的淀粉酶溶液，低速攪拌。用鋁箔片將燒杯蓋住，在95-100℃水浴中反應30分鐘。（起始的水浴溫度應達到95℃）。
（4）冷卻：所有燒杯從水浴中移出，涼至60℃。打開鋁箔蓋，用刮勺將燒杯邊緣的網狀物以及燒杯底部的膠狀物刮離，以使樣品能夠完全的酶解。用10ml蒸餾水沖洗燒杯壁和刮勺。
（5）用蛋白酶進行酶解處理：在每個燒杯中各加入100μl蛋白酶溶液。用鋁箔蓋住，在60℃持續搖動反應30分鐘（開始時的水浴溫度應達60℃），使之充分反應。
（6） pH值測定：30分鐘后，打開鋁箔蓋，攪拌中加入5ml0.561mol/L HCL至燒杯中。60℃時用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCL溶液調最終pH為4.0-4.7。（注意：當溶液為60℃時檢測和調整pH，因為在較低溫度時pH會偏高。）
（7）用淀粉葡糖苷酶溶液酶解處理：攪拌同時加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。用鋁箔蓋住，在60℃持續振搖反應30分鐘，溫度應恒定在60℃。
5.3 測定
5.3.1.總的膳食纖維測定
（1）用乙醇沉淀膳食纖維：在每份樣品中，加入預熱至60℃的95%乙醇225ml，乙醇與樣品的體積比為4∶1。室溫下沉淀1小時。
（2）過濾裝置：用15ml78%乙醇將硅藻土濕潤和重新分布在已稱重的坩堝中。用適度的抽力把坩堝中的硅藻土吸到玻板上。
（3）酶解過濾，用78%乙醇和刮勺轉移所有內容物微粒到坩堝中。（注意：如果一些樣品形成膠質，用刮勺破壞表面，以加速過濾。）
（4）抽真空，分別用15ml的78%乙醇，95%乙醇和丙酮沖洗殘渣各2次，將坩堝內的殘渣抽干后在105℃烘干過夜。將坩堝置干燥器中冷卻至室溫。坩堝重量，包括膳食纖維殘渣和硅藻土，精確稱至0.1mg。減去坩堝和硅藻土的干重，計算殘渣重。
（5）蛋白質和灰分的測定:取成對的樣品中的一份測定蛋白質，用本書前述或GB-960.52方法測定。用（N×6.25作為蛋白質的轉換系數）。
分析灰分時用平行樣的第二份在525℃灼燒5小時，在干燥器中冷卻，精確稱至0.1mg，減去坩堝和硅藻土的重量，即為灰分重量。
5.3.2 .不溶性膳食纖維測定：
（1）稱適量樣品按5.2進行酶解，過濾前用3ml水濕潤和重新分布硅藻土在預先處理好的坩堝上，保持抽氣使坩堝中的硅藻土抽成均勻的一層。
（2）過濾并沖洗燒杯，用10ml70℃水洗殘渣2次，然后再過濾并用水洗，轉移到600ml高腳燒杯，保留用以測定可溶性膳食纖維，按5.3.3。
（3）用抽濾裝置，分別用15ml78%乙醇，95%乙醇和丙酮各沖洗殘渣2次。
（注意：應及時用78%乙醇、95%乙醇和丙酮沖洗殘渣否則可造成不溶性膳食纖維數值的增大。）
（4）按5.3.1.5用雙份樣品測定蛋白質和灰分。
5.3.3.可溶性膳食纖維測定：
（1）將不溶性膳食纖維過濾后的濾液收集到600ml高腳燒杯中，對比燒杯和濾過液，估計容積。
（2）加約濾出液4倍量已預熱至60℃的95%乙醇?；蛘邔V液和洗過殘渣的蒸餾水的混合液調至80g，再加入預熱至60℃的95%乙醇320ml。
（3）室溫下沉淀1小時。下面按5.3.1測定總膳食纖維，從"濕潤和重新分布硅藻土……"。
6. 計算
TDF、IDF、SDF均用同一公式計算
膳食纖維（DF，g/100g）測定：
DF={[（R1+R2）/2]-P-A}/[（M1+M2）/2]×100
式中：R1和R2=雙份樣品殘留物重量（mg）
P和A=分別為蛋白質和灰分重量（mg）
M1和M2=樣品重量（mg）

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