生物活性肽的功能與制備研究進展

　　摘  要：對生物活性肽的研究進展進行了綜述，重點闡述了生物活性肽的分類和合成方法，并對發展前景進行了展望。

　　關鍵詞：生物活性肽；合成；脫苦

　　生物活性肽是指具有生物活性的多肽，這些多肽小到只有2個氨基酸的雙肽，也可以大到復雜的長鏈或環狀多肽，而且常經過糖苷化、磷酸化或?；苌?，在細胞生理及代謝功能的調節上具有重要的作用。特別是短肽的發現已經成為多肽類藥物和功能性食品添加劑的開發熱點。

　　以數個氨基酸結合生成的低肽比氨基酸有更好的消化吸收性能，且營養和生理效果更為優越。不僅如此，其中許多肽還具有原蛋白質或其組成氨基酸所沒有的新功能。這些生物活性肽都以非活性狀態存在于蛋白質的長鏈之中，當用適當的蛋白酶水解時，它們的活性就被釋放出來［1］。

　　1  生物活性肽的分類

　　按照功能的不同，可分為以下幾類［2］。

　　1.1  生理活性肽（Physiogically Active Peptides）

　　1.1.1  抗菌肽和抗病毒多肽  包括由細菌與真菌而來的環肽、糖肽、脂肽等；另外,Yingzhang［3］從蠶豆（Vicia faba）這種豆類植物中也獲得了植物抗菌肽，命名為Fabatine,但它只對革蘭氏陽性和陰性細菌有效，而對酵母無效；Holz［4］研究了真核和原核生物中核糖體合成的抗菌肽，如：桿菌素、昆蟲防御素、attacin和脊椎動物中的抗菌肽。

目前有天然抗菌肽在醫藥上的應用，運用到食品工業上有部分取代化學防腐劑的趨勢，如Nisin的使用。

　　1.1.2  神經活性肽  主要存在于牛乳、鮪魚、大豆及其它豆類等許多食品蛋白質的水解物中，如酪激肽、乳啡肽、α-內啡肽（α-endorphin）、亮氨酰-腦啡肽（Leu-enkephalin）、甲硫氨酰-腦啡肽（Met-enkephalin）。它們能調節神經的信息傳遞，現已成為食品藥理學的焦點之一。

　　1.1.3  酶調節及抑制肽  這類多肽參與了許多生化代謝的途徑，其中可以抑制血管收縮素轉換酶（ACE）活性的多肽已經被用作抗高血壓的藥劑［5］，其蛋白質序列C端多半為脯氨酸，且可以在牛乳酪蛋白、魚肌肉、玉米蛋白質等水解物及許多發酵食品中發現。

　　1.1.4  激素及激素調節肽  包括垂體后葉催產素（Dxy-tocin）、促腎上腺皮質激素（ACTH）、垂體后葉加血壓激素（Vasopresssin）、生長激素抑制素（Somatostatin）等，它們具有促進平滑肌收縮、促進類固醇合成以及促進血管收縮的功能。

　　1.1.5  免疫活性肽  人體內的中間白色胞素（interl-eukin）與干擾素（interferon）是一些可以活化與調節免疫反應的多肽，而食品成分中的一些多肽片段也被發現具有免疫活性，如來自γ-麥醇蛋白中的N端八肽。除此之外，還包括來自一些病原微生物的免疫誘導表面肽、糖肽，以及一些非食物和食物來源的變異原等。

　　1.2  其它生物活性肽

　　科學工作者已從植物和動物蛋白質中分離出了多種毒素，如：蓖麻蛋白（ricin）、刀豆球蛋白（concavalins）、紅豆堿（abrin）和蜂毒（mellitin）等；具有抑制酶（尤其是胃蛋白酶）活性的多肽在豆類植物中被發現，這類酶抑制肽會降低蛋白質的生物利用率，但有趣的是，它們在體內卻有抑制癌變的潛力；其它食物來源肽，如磷蛋白肽可與二價或三價微量元素（鈣、鎂和鐵）螯合而加快礦物質在體內的運輸；一些食物來源肽還具有微妙的生理作用，如來自奶酪乳清中的“唾液酪蛋白巨肽”對食欲有控制作用。

　　長期以來，對多肽的研究集中在內源生物活性肽的醫學作用上，而它們在食品質構中的作用則是最近的研究熱點。已經認識到多肽對食品感官風味存在一定的影響，在有些食品中（尤其是奶酪），它的苦味、甜味、酸味以及肉湯味和杏仁味的產生都認為與乳蛋白水解產生的某些肽類有關。有的研究還發現，多肽對提高凍藏肉的風味也有貢獻，在最近幾年內，已有大量食品來源的多肽被分離和鑒定，其開發重點是食品甜味劑、抗氧化劑、風味劑和營養強化劑。

　　1.2.1  感官肽（sensory peptides）  阿斯巴甜二肽和天門冬酰丙氨酸酯是甜度較高，且不產能的甜味劑。迄今為止，阿斯巴甜被75個國家核準使用在數百種的食品和保健產品中，其商業化的成功，促使了更多甜味劑的研究?，F已發現了甜味劑的幾種新型結構，如含賴氨酸的轉化阿斯巴甜二肽、氨基丙二酸二肽，它們可作為阿斯巴甜的替代物，而且在食品加工中不象阿斯巴甜那樣呈現酯的性質，所以更為穩定。

　　天然多肽甜味劑的來源主要是一些植物蛋白，如：莫那靈（monellin）、沙馬?。╰haumatin）、仙茅甜蛋白（curculin）、馬檳榔甜蛋白（mabinlin）等，它們已進入到產品利用上的評估階段，可以用作精選食品的甜味劑。而且curculin和另外一種水果雙肽miraculin，還能掩蔽酸味，使之轉化為甜味。

　　雖然大多數情況下要避免食品產生苦味，但在許多食品中，如：啤酒、咖啡、水果汁和奶酪，苦味卻是其中一個重要的感官成分。已從發酵食品中，如奶酪、可可、沙淇酒和蛋白質水解物中分離出了苦味肽，并對其進行了初步的構象—呈味關系研究，結果發現苦味主要由分子中的疏水性氨基酸和堿性氨基酸造成的［6］?，F在已提出多種模型解釋多肽苦味與特殊氨基酸的存在、它們在多肽中的相對位置以及多肽的整體構造之間的關系。

　　酸味肽對酸味和Umami風味的形成是必需的,Umami風味與谷氨酸單鈉（MSG）風味相似，是由含有谷氨酸和天門冬氨酸二肽和三肽的鈉鹽所致（若是游離氨基酸形式則不呈酸味，若含有γ-谷氨酸的多肽則有澀味）。Umami風味是許多食品風味的基本成分，研究發現，具有Umami風味的多肽順序為Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Se-Leu-Ala，這種八肽最早是從木瓜蛋白酶處理后的牛肉中分離得到，被稱為“美味肽”，是構成牛肉湯風味的主體［7］。美味肽的風味是由其結構中的3部分共同作用的結果：N-端堿性二肽Lyn-Gly，中間酸性三肽Asp-Glu-Glu和C-端三肽Ser-Leu-Ala。若將上述3種成分混合，或用orn-γ－Ala（咸味肽）代替其中的堿性三肽組分，或則Glu-Glu代替其中的酸性三肽組分，也能產生類似“美味肽”的風味和閾值。

　　某些堿性二肽具有很濃的咸味，協同構成了Umami風味，但其味感與氨基酸的離子化程度和反離子的存在有很大關系。Umami風味和咸味肽的協同運用主要是作為糖尿病人和高血壓患者以及保健食品中的“無鈉”調味料。

　　多肽在食品風味里發揮的作用并不僅局限于它們對基本味的貢獻，象Glu-Leu、Pro-Glu或Val-Ghu等二肽是通過它們的緩沖作用而增強食品風味的；而谷氨酸寡聚肽則是以苦味掩蔽劑的形式添加到蔬菜汁或果汁中；γ－谷胺酰多肽是蔥類的風味前體；在面包、可可和花生發酵時釋放出的短肽，它們能在焙烤時形成多種雜環芳香族的化合物，這是通過多肽與糖的美拉德反應及其降解而形成的［8］。相對而言，對氨基酸在熱降解時產生風味物已做了深入的研究，而對多肽在這些反應中的作用卻研究得較少。

　　1.2.2  抗氧化肽  某些多肽及蛋白質水解物可以降低油脂食品的自動氧化速率與過氧化物的含量，其原理不外乎捕捉金屬離子或者是促進過氧化物的降解。美拉德反應產物--類黑精能與重金屬離子螯合（尤其是鐵）而形成無氧化力的復合物，從而降低氧化速率。大部分抗氧化肽的片段中含有組氨酸［9］。

　　肌肽（camosine，β-Ala-His）是存在于動物肌肉中的一種天然二肽，能抑制體外由鐵、血紅素、脂氧化酶和單線態氧催化的脂氧化，也能抑制蒸煮肉在冷藏時的氧化酸敗，因而在肉制品工藝中具有極好的應用前景，可作為天然抗氧化劑使用?？寡趸钚噪娜缂‰?、谷胱甘肽、大豆蛋白酶解物等作為天然抗氧化物具有低毒、高效等特點，具有應用的優勢［10］。

含有寡肽的各類天然食品都能抑制多酚氧化酶（PPO）的活性，如土豆和蘑菇中含有低分子二肽（約1000Da）能抑制蘋果干和葡萄汁中的PPO。除此之外，這些肽可能還直接與PPO的催化產物醌作用而阻止了黑色多聚氧化產物的形成，從而降低了酶促反應的速度。
　　1.2.3  表面活性肽  酶水解蛋白質時常常會破壞蛋白質的功能性質。但在某些情況下，酶水解卻能提高蛋白質的功能性質，這一方面是由于產生了具有較低結構級數（二級）的多肽，另一方面是由于提高了蛋白質在等電點附近的溶解度。我們經常從酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白和面筋蛋白水解物中獲得多肽，如一些酪蛋白多肽段：α－S1-CN（1-23）、β-CN（193-209）和β-CN（1-25）等，它們在食品中就具有很好的穩定性和乳化能力，從而改善了酪蛋白的功能性質。此外，對蛋白質進行適度水解，還可以提高其起泡性。在啤酒泡沫的成分中，含高分子多肽、糖肽和類黑精，這些表面活性劑對泡沫的形成和穩定起著關鍵的作用。

　　1.2.4  營養肽  在營養不良或消化吸收有問題的病人的配方食品上，多肽或蛋白質水解物已經逐漸取代氨基酸作為氮源的應用。人們已經證明二肽與三肽被人體吸收的效率較氨基酸高［7］。將γ－Glu-Lyn強化在小麥面筋中制造面包是非常好的Lyn來源，常在苯丙酮酸尿病患者膳食中添加由游離苯丙氨酸構成的多肽。而且由于多肽的低抗原性使其對牛乳蛋白過敏兒童的低過敏嬰兒配方食品中得以廣泛的應用。

　　從人乳和牛乳蛋白中分離獲得的營養活性肽是關注的焦點，一些來自酪蛋白和β－casomorphin的磷酸肽已經作為膳食強化劑和藥物在使用。它們具有廣泛的生理活性，如：免疫調節、預防高血壓、抗凝血和調節礦物質的吸收等，因此奶制品或乳制品既是營養品，又是生理活性物質。雖然對牛乳肽在體外的作用有大量的研究，而對其在體內的重要作用至今尚不清楚。

　　以上討論了多肽在食品和醫藥工業中的應用，但是大規模合成或從天然資源中分離活性肽實際上非常困難，且費用昂貴，這是限制多肽產品面市的主要原因。因此，許多學者努力尋求其它途徑來大規模生產多肽。

　　2  多肽生產

　　2.1  概述

　　生物技術的發展，為人們從食品蛋白質中生產特殊的活性肽提供了條件。人們獲得活性肽的來源有：①存在于生物體中的各類天然活性肽（激素類、酶抑制劑等）；②消化過程中產生或體外水解蛋白質產生；③通過化學方法（液相或固定相）、酶法、重組DNA技術合成。

　　在過去10年，對多肽合成已進行了一些基礎研究（主要是一些高價值藥物肽）。如生物活性肽類似物、蛋白酶和激酶底物以及病毒表面蛋白序列（產生位點專一抗體）的合成。具體選用哪一種應根據所需肽的鏈長和質量而定。目前酶法合成只局限于短肽的合成，而重組DNA技術則能合成大分子肽（含高達幾百個氨基酸殘基的巨肽），固相合成法則是用來合成中等鏈長多肽的主要方法。

　　2.2  化學合成法

　　實驗室水平下常用化學合成法，按其合成介質可分為“液相合成”和“固相合成”。固相合成法在20世紀60年代才出現，與傳統的液相合成法并駕齊驅，其優越性在于固相載體有利于合成中不斷增長的肽鏈固定、環化、去保護和純化，且易實現自動化。然而，由于設備和試劑的昂貴嚴重限制了固定相合成法在規?；a上應用。目前主要在合成含有10～100個殘基的多肽或為篩選而快速建立多肽庫時應用。雖然液相合成法是合成小分子肽的濃縮多肽片段的有效方法，但化學合成法本身具有下述缺點：①消旋化和副反應；②需要對肽側鏈中的基因進行保護，尤其是固相合成時；③需過量的鏈接試劑和?；d體；④鏈接試劑的毒性殘留影響制品和環境。

　　2.3  重組DNA法

　　重組DNA法沒有上述缺點，但需要一個長期的研究與開發階段。若一旦建立起了一個重組DNA體系，就可以利用廉價的原料經發酵大量生產活性肽，如果有望成功，將會有廣闊前景。然而迄今即使用此法來制備小分子肽也沒有取得成功。

　　2.4  酶法

　　采用酶法生產是當前研究的熱點，因其安全性極高、價廉、易于推廣而引起人們的極大興趣。

　　大多數活性肽的生產流程為：原料蛋白→預處理→酶解→分離→精制→成品。

　　酶的選擇是生產活性肽的關鍵。目前商業用酶主要是微生物酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復合酶）、植物蛋白酶及少量的動物蛋白酶，當前的研究者常常要從大量的酶中進行篩選，雖能根據原料蛋白的組成和酶的專一性作為參考，但仍存在較大的盲目性。因此，研究者可根據活性肽的結構特點，通過酶工程來生產特定的酶類［11］。由于單憑一種酶有時很難達到預期效果，可用復合酶系［12］。盡管人們在生產中已采用了復合酶系，但由于酶反應體系是一個復雜的體系，共同作用機理仍有待于進一步的　　　　探討［13］。

　　另外，也有研究者直接利用微生物在原料中發酵，如Leblanc等用瑞士乳桿菌發酵牛奶得到抗大腸桿菌O157：H7感染的多肽［14］。利用基因工程對生產生物活性肽的酶進行改造，從而獲得新特性的活性肽，也會是一個重要的發展方向［15］。

　　2.5  酶法生產存在的問題和解決方法

　　2.5.1  存在問題

　　雖然采用酶法成功合成了許多復雜的多肽序列，如阿斯巴甜。但酶在水相中存在的問題越來越明顯，最主要的是副反應多，特別是對肽鍵的水解，導致在合成大分子寡肽時會產生大量副產物；另外一個問題就是許多氨基酸衍生物在水中的穩定性很差。雖然“非水相酶學”獲得了長足的發展，但現仍局限在模型二、三肽的合成。

此外，在蛋白質酶水解時會形成苦味肽，這嚴重限制了蛋白質水解物的利用。水解物的苦味是由含一個疏水區和一個親水區，二者相距3A的肽產生，其中氨基與親核接受器的相互作用和疏水相互作用而引起苦味?？辔妒堑鞍踪|酶解的必然結果，其強弱程度是決定水解物在食品中應用的關鍵因素。因此許多脫苦方法應運而生，包括選擇性分離、掩蔽、酶處理/多肽外切酶的應用。

　　2.5.2  解決辦法

　?。?）選擇性分離  最早用活性炭對酪蛋白水解物進行選擇性分離來脫苦。其機理是，活性炭作為疏水吸附劑與疏水性苦味肽及氨基酸結合。其它疏水吸附劑還有瓊脂疏水色譜、雙氧樹脂纖維素、酚醛樹脂和免疫專一吸附劑等。另外，用水合乙醇能有效地去除苦味肽，此法可用于工業化生產中。

　　但是通過吸附的方式除掉苦味肽時，會引起蛋白質和氨基酸的損失，降低營養價值。

　?。?）掩蔽  有許多物質能夠掩蔽水解的苦味，如五聚磷酸鹽、膠原蛋白、甘氨酸環狀糊精等。將苦味肽和蛋白質混合，能有效降低苦味，這是因為蛋白質和氨基酸及多肽之間有親合力。眾所周知，苦味與酸味混合可減輕苦味，因而，也可用谷氨酸或天門冬氨酸掩蔽苦味但產品有點酸澀。若添加過量的?；撬岷?，產品可不帶酸味。

　?。?）酶處理/多肽外切酶的應用  類蛋白反應（Plastein Reaction）是一種有效脫苦方法，將部分水解的蛋白物與特定的蛋白酶保溫后能形成“類蛋白”，這是一類類似蛋白質的高分子物質，與原蛋白質的性質不同，且不再有原來的特殊風味。

　　3  研究開發生物活性肽的前景

　　源于蛋白質的活性肽是一種多功能因子，其組成氨基酸并不一定是必需氨基酸，這就為人類更為充分利用那些原本認為生物價不高的蛋白質資源，從而生產出更能滿足人類保健需要的基料提供了新的機遇。

我國有大量豐富蛋白質資源，由于原料利用率不高，農副產品加工中產生的大量下腳料和工業廢物中含有大量的蛋白質。若采用生物技術進行蛋白質的深加工，會有廣闊的社會效益和經濟效益?！?/FONT>